Біофармацевтичні препарати: вичерпний посібник з виробництва білкових ліків

Біофармацевтичні препарати, також відомі як біологічні препарати, є сегментом фармацевтичної промисловості, що стрімко зростає. На відміну від традиційних низькомолекулярних ліків, що синтезуються хімічним шляхом, біофармацевтичні препарати — це великі, складні молекули, що виробляються за допомогою живих клітин або організмів. Білкові ліки, значна підгрупа біофармацевтичних препаратів, пропонують таргетну терапію для широкого спектра захворювань, включаючи рак, аутоімунні розлади та інфекційні хвороби. Цей посібник надає вичерпний огляд виробництва білкових ліків, охоплюючи ключові аспекти від розробки клітинних ліній до кінцевого складування продукту та контролю якості.

Що таке білкові ліки?

Білкові ліки — це терапевтичні білки, призначені для лікування або профілактики захворювань. Вони включають різноманітні молекули, такі як:

• Моноклональні антитіла (мАт): Високоспецифічні антитіла, що націлені на конкретні антигени, часто використовуються в імунотерапії раку та лікуванні аутоімунних захворювань. Приклади включають адалімумаб (Humira®) та трастузумаб (Herceptin®).
• Рекомбінантні білки: Білки, вироблені за допомогою технології рекомбінантної ДНК, що дозволяє великомасштабне виробництво терапевтичних білків. Інсулін (Humulin®) є класичним прикладом.
• Ферменти: Білки, що каталізують біохімічні реакції, використовуються для лікування ферментної недостатності або інших метаболічних розладів. Приклади включають іміглюцеразу (Cerezyme®) для лікування хвороби Гоше.
• Гібридні білки: Білки, створені шляхом з'єднання двох або більше білків, часто використовуються для підвищення терапевтичної ефективності або націлювання на конкретні клітини. Етанерцепт (Enbrel®) є гібридним білком, що використовується для лікування ревматоїдного артриту.
• Цитокіни та фактори росту: Білки, що регулюють ріст та диференціацію клітин, використовуються для стимуляції імунної системи або сприяння відновленню тканин. Прикладами є інтерферон альфа (Roferon-A®) та еритропоетин (Epogen®).

Процес виробництва білкових ліків: загальний огляд

Процес виробництва білкових ліків є складним, багатоетапним процесом, що вимагає суворого контролю та ретельного виконання. Загальний робочий процес можна розділити на наступні етапи:

1. Розробка клітинної лінії: Вибір та інженерія клітин для ефективного виробництва бажаного білка.
2. Апстрім-процесинг: Культивування клітин у біореакторах для максимізації експресії білка.
3. Даунстрім-процесинг: Виділення та очищення білка з клітинної культури.
4. Розробка лікарської форми та розлив: Підготовка кінцевого лікарського засобу у відповідній лікарській формі для введення.
5. Контроль якості та аналітика: Забезпечення безпеки, ефективності та стабільності лікарського засобу.

1. Розробка клітинної лінії: основа виробництва білка

Клітинна лінія, що використовується для виробництва білка, є критичним фактором, що визначає якість та вихід кінцевого продукту. Клітинні лінії ссавців, такі як клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO), широко використовуються завдяки їхній здатності виконувати складні посттрансляційні модифікації (наприклад, глікозилювання), які часто є важливими для функції білка та імуногенності. Інші клітинні лінії, включаючи клітини ембріональної нирки людини (HEK) 293 та клітини комах (наприклад, Sf9), також використовуються залежно від конкретного білка та його вимог.

Ключові аспекти розробки клітинної лінії:

• Рівні експресії білка: Вибір клітин, що виробляють велику кількість цільового білка, є вирішальним для ефективного виробництва. Це часто включає генну інженерію для оптимізації експресії генів.
• Якість білка: Клітинна лінія повинна виробляти білок з правильним згортанням, глікозилюванням та іншими посттрансляційними модифікаціями для забезпечення належної функції та мінімізації імуногенності.
• Стабільність клітин: Клітинна лінія повинна бути генетично стабільною, щоб забезпечити послідовне виробництво білка протягом багатьох поколінь.
• Масштабованість: Клітинна лінія повинна бути придатною для великомасштабного культивування в біореакторах.
• Відповідність нормативним вимогам: Клітинна лінія повинна відповідати нормативним вимогам щодо безпеки та якості.

Приклад: розробка клітинної лінії CHO

Клітини CHO зазвичай модифікують для експресії рекомбінантних білків за допомогою різних методів, зокрема:

• Трансфекція: Введення гена, що кодує цільовий білок, у клітини CHO.
• Селекція: Відбір клітин, які успішно інтегрували ген і експресують білок. Це часто включає використання селективних маркерів (наприклад, генів стійкості до антибіотиків).
• Клонування: Ізоляція окремих клітин та вирощування їх у клональні клітинні лінії. Це гарантує, що всі клітини в популяції є генетично ідентичними.
• Оптимізація: Оптимізація умов культивування клітин (наприклад, склад середовища, температура, pH) для максимізації експресії та якості білка.

2. Апстрім-процесинг: культивування клітин для виробництва білка

Апстрім-процесинг включає культивування обраної клітинної лінії в біореакторах для виробництва цільового білка. Біореактор забезпечує контрольоване середовище з оптимальними умовами для росту клітин та експресії білка. Ключові параметри, які необхідно ретельно контролювати, включають температуру, pH, розчинений кисень та постачання поживних речовин.

Типи біореакторів:

• Періодичні біореактори: Закрита система, де всі поживні речовини додаються на початку культивування. Це простий і недорогий метод, але виробництво білка обмежується виснаженням поживних речовин і накопиченням продуктів життєдіяльності.
• Періодичні біореактори з підживленням: Поживні речовини додаються періодично під час культивування для підтримки оптимального росту клітин та експресії білка. Це дозволяє досягти вищих щільностей клітин та виходів білка порівняно з періодичними культурами.
• Безперервні біореактори (перфузійні): Поживні речовини постійно додаються, а продукти життєдіяльності постійно видаляються. Це забезпечує стабільне середовище для росту клітин та експресії білка, що призводить до ще вищих щільностей клітин та виходів білка. Перфузійні системи часто використовуються для великомасштабного виробництва.

Оптимізація середовища:

Культуральне середовище забезпечує поживні речовини та фактори росту, необхідні для росту клітин та виробництва білка. Оптимальний склад середовища залежить від клітинної лінії та цільового білка. Оптимізація середовища включає коригування концентрацій різних компонентів, таких як:

• Амінокислоти: Будівельні блоки білків.
• Вітаміни: Необхідні для клітинного метаболізму.
• Фактори росту: Стимулюють ріст та диференціацію клітин.
• Солі та мінерали: Підтримують осмотичний баланс та забезпечують необхідні іони.
• Цукри: Забезпечують енергію для клітинного метаболізму.

Моніторинг та контроль процесу:

Під час апстрім-процесингу важливо контролювати ключові параметри процесу для забезпечення оптимального росту клітин та експресії білка. Це включає використання датчиків для вимірювання таких параметрів, як температура, pH, розчинений кисень, щільність клітин та концентрація білка. Системи керування використовуються для автоматичного коригування цих параметрів, щоб підтримувати їх у бажаному діапазоні.

3. Даунстрім-процесинг: виділення та очищення білка

Даунстрім-процесинг включає виділення та очищення цільового білка з клітинної культури. Це критичний етап у процесі виробництва білкових ліків, оскільки він видаляє домішки, які можуть вплинути на безпеку та ефективність кінцевого продукту. Даунстрім-процесинг зазвичай включає низку етапів, зокрема:

Руйнування клітин:

Якщо білок знаходиться всередині клітин, клітини необхідно зруйнувати, щоб вивільнити білок. Це можна зробити за допомогою різних методів, таких як:

• Механічне руйнування: Використання гомогенізації під високим тиском або ультразвукової обробки для руйнування клітин.
• Хімічне руйнування: Використання детергентів або органічних розчинників для розчинення клітинних мембран.
• Ферментативне руйнування: Використання ферментів для руйнування клітинних стінок.

Освітлення:

Після руйнування клітин необхідно видалити клітинні уламки, щоб освітлити розчин білка. Це зазвичай досягається за допомогою центрифугування або фільтрації.

Очищення білка:

Потім білок очищують за допомогою різноманітних хроматографічних методів, таких як:

• Афінна хроматографія: Використовує ліганд, який специфічно зв'язується з цільовим білком. Це дуже селективний метод, який може забезпечити високу чистоту за один етап. Наприклад, антитіла або білки з мітками (наприклад, His-мічені білки) часто очищують за допомогою афінної хроматографії.
• Іонообмінна хроматографія: Розділяє білки на основі їхнього заряду. Катіонообмінна хроматографія використовується для зв'язування позитивно заряджених білків, тоді як аніонообмінна хроматографія використовується для зв'язування негативно заряджених білків.
• Ексклюзійна хроматографія (гель-фільтрація): Розділяє білки на основі їхнього розміру. Більші білки елююються першими, тоді як менші білки елююються пізніше.
• Хроматографія гідрофобної взаємодії: Розділяє білки на основі їхньої гідрофобності. Гідрофобні білки зв'язуються з колонкою при високих концентраціях солі та елююються зі зменшенням концентрації солі.

Ультрафільтрація/Діафільтрація:

Ультрафільтрація та діафільтрація використовуються для концентрування розчину білка та видалення солей та інших малих молекул. Ультрафільтрація використовує мембрану для розділення молекул за розміром, тоді як діафільтрація використовує мембрану для видалення малих молекул шляхом додавання буфера. Цей етап є вирішальним для підготовки білка до розробки лікарської форми.

Видалення вірусів:

Видалення вірусів є критично важливим аспектом безпеки для біофармацевтичних препаратів. Даунстрім-процесинг повинен включати етапи для видалення або інактивації будь-яких вірусів, які можуть бути присутніми в клітинній культурі. Це можна досягти за допомогою фільтрації, хроматографії або термічної інактивації.

4. Розробка лікарської форми та розлив: підготовка кінцевого лікарського засобу

Розробка лікарської форми включає підготовку очищеного білка у стабільній та придатній формі для введення пацієнтам. Лікарська форма повинна захищати білок від деградації, підтримувати його активність та забезпечувати його безпеку.

Ключові аспекти розробки лікарської форми:

• Стабільність білка: Білки чутливі до деградації під впливом різних факторів, таких як температура, pH, окислення та агрегація. Лікарська форма повинна захищати білок від цих факторів.
• Розчинність: Білок повинен бути розчинним у лікарській формі, щоб забезпечити легке введення.
• В'язкість: В'язкість лікарської форми повинна бути достатньо низькою для легкого введення ін'єкції.
• Тонічність: Тонічність лікарської форми повинна бути сумісною з рідинами організму, щоб уникнути болю або подразнення при ін'єкції.
• Стерильність: Лікарська форма повинна бути стерильною для запобігання інфекції.

Поширені допоміжні речовини, що використовуються в білкових лікарських формах:

• Буфери: Підтримують pH лікарської форми. Приклади включають фосфатні буфери, цитратні буфери та Тріс-буфери.
• Стабілізатори: Захищають білок від деградації. Приклади включають цукри (наприклад, сахарозу, трегалозу), амінокислоти (наприклад, гліцин, аргінін) та поверхнево-активні речовини (наприклад, полісорбат 80, полісорбат 20).
• Модифікатори тонічності: Регулюють тонічність лікарської форми. Приклади включають хлорид натрію та манітол.
• Консерванти: Запобігають росту мікробів. Приклади включають бензиловий спирт та фенол. (Примітка: Консервантів часто уникають у лікарських формах для одноразового застосування).

Розлив та укупорка:

Розлив та укупорка включають асептичне наповнення флаконів або шприців лікарським засобом на основі білка. Це критичний етап, який повинен виконуватися в суворих стерильних умовах для запобігання контамінації. Наповнені флакони або шприци потім маркуються, пакуються та зберігаються у відповідних умовах.

5. Контроль якості та аналітика: забезпечення безпеки та ефективності продукту

Контроль якості (КЯ) є невід'ємною частиною виробництва білкових ліків. Він включає низку тестів та аналізів для забезпечення відповідності лікарського засобу попередньо визначеним специфікаціям щодо безпеки, ефективності та стабільності. Тестування КЯ проводиться на різних етапах виробничого процесу, від розробки клітинної лінії до випуску кінцевого продукту.

Ключові тести контролю якості:

• Тестування на ідентичність: Підтверджує, що лікарський засіб є правильним білком. Це можна досягти за допомогою різних методів, таких як пептидне картування та мас-спектрометрія.
• Тестування на чистоту: Визначає кількість домішок у лікарському засобі. Це можна досягти за допомогою різних хроматографічних методів, таких як ВЕРХ та SDS-PAGE.
• Тестування на активність: Вимірює біологічну активність лікарського засобу. Це можна досягти за допомогою клітинних аналізів або аналізів зв'язування.
• Тестування на стерильність: Підтверджує, що лікарський засіб не містить мікробної контамінації.
• Тестування на ендотоксини: Вимірює кількість ендотоксинів у лікарському засобі. Ендотоксини — це бактеріальні токсини, які можуть викликати лихоманку та запалення.
• Тестування на пірогенність: Виявляє наявність пірогенів, речовин, що можуть викликати лихоманку.
• Тестування на стабільність: Оцінює стабільність лікарського засобу з часом за різних умов зберігання.

Аналітичні методи, що використовуються в КЯ біофармацевтичних препаратів:

• Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ): Використовується для розділення та кількісного визначення різних компонентів у суміші.
• Мас-спектрометрія (МС): Використовується для ідентифікації та кількісного визначення білків та інших молекул.
• Електрофорез (SDS-PAGE, капілярний електрофорез): Використовується для розділення білків за розміром та зарядом.
• Імуноферментний аналіз (ІФА/ELISA): Використовується для виявлення та кількісного визначення специфічних білків.
• Клітинні аналізи: Використовуються для вимірювання біологічної активності білків.
• Біошарова інтерферометрія (BLI): Використовується для вимірювання білок-білкових взаємодій.
• Поверхневий плазмонний резонанс (SPR): Також використовується для вимірювання білок-білкових взаємодій та кінетики зв'язування.

Нормативні аспекти

Виробництво біофармацевтичних препаратів суворо регулюється регуляторними органами по всьому світу, такими як Управління з продовольства і медикаментів США (FDA), Європейське агентство з лікарських засобів (EMA) та Всесвітня організація охорони здоров'я (ВООЗ). Ці агенції встановлюють стандарти для виробничих процесів, контролю якості та клінічних випробувань для забезпечення безпеки та ефективності біофармацевтичних продуктів. Ключові регуляторні настанови включають Належну виробничу практику (GMP), яка визначає вимоги до виробничих потужностей, обладнання та персоналу.

Біосиміляри: ринок, що зростає

Біосиміляри — це біофармацевтичні продукти, які є дуже подібними до вже затвердженого референтного продукту. Вони не є точними копіями референтного продукту через притаманну складність біологічних молекул та виробничих процесів. Однак, біосиміляри повинні продемонструвати високу подібність до референтного продукту з точки зору безпеки, ефективності та якості. Розробка та затвердження біосимілярів надають можливість знизити витрати на охорону здоров'я та збільшити доступ пацієнтів до важливих ліків. Країни по всьому світу мають різні регуляторні шляхи для затвердження біосимілярів, але основним принципом є забезпечення порівнянності з оригінальним біологічним препаратом.

Майбутні тенденції у виробництві білкових ліків

Сфера виробництва білкових ліків постійно розвивається, з'являються нові технології та підходи для підвищення ефективності, зниження витрат та покращення якості продукції. Деякі з ключових тенденцій, що формують майбутнє виробництва білкових ліків, включають:

• Безперервне виробництво: Перехід від періодичного до безперервного виробництва, що забезпечує підвищену ефективність, зниження витрат та покращену якість продукції.
• Процесна аналітична технологія (PAT): Використання моніторингу та контролю процесів у реальному часі для оптимізації виробничих процесів та забезпечення стабільної якості продукції.
• Одноразові технології: Використання одноразового обладнання для зниження ризику контамінації та усунення потреби в очищенні та стерилізації.
• Високопродуктивний скринінг: Використання автоматизованих систем для скринінгу великої кількості клітинних ліній та умов процесу для визначення оптимальних умов виробництва білка.
• Передові аналітичні методи: Розробка більш складних аналітичних методів для характеристики складної структури та функції білкових ліків.
• Персоналізована медицина: Адаптація терапії білковими ліками до окремих пацієнтів на основі їхнього генетичного складу та інших факторів. Це включає розробку супутньої діагностики для виявлення пацієнтів, які найімовірніше отримають користь від певної терапії.
• Штучний інтелект та машинне навчання: Використання штучного інтелекту та машинного навчання для оптимізації дизайну, виробництва та розробки лікарських форм білкових ліків. Це включає прогнозування структури та функції білка, оптимізацію умов культивування клітин та розробку більш стабільних та ефективних лікарських форм.

Висновок

Виробництво білкових ліків — це складний та вимогливий процес, що вимагає мультидисциплінарного підходу. Від розробки клітинної лінії до кінцевої розробки лікарської форми та контролю якості, кожен етап повинен ретельно контролюватися для забезпечення безпеки, ефективності та стабільності лікарського засобу. Оскільки технології продовжують розвиватися, сфера виробництва білкових ліків готова до подальших інновацій, що призведе до розробки нових та вдосконалених методів лікування широкого спектра захворювань. Зростаючий світовий попит на біофармацевтичні препарати вимагає постійного вдосконалення виробничих процесів для задоволення потреб пацієнтів у всьому світі. Розробка біосимілярів також надає можливості для розширення доступу до цих життєво важливих ліків.